摘　要：以优质五粮发酵池的窖泥为基材，对其进行热选条件的优化，分离纯化后得到的己酸菌制成己酸菌液。观察其产气能力、生长周期、活菌数量，用以得到最优化的热处理条件。

实验中五粮发酵池的窖泥菌液，在90℃恒温处理5min，冷却后接入己酸菌培养液中培养，得到的己酸菌更优质。

关键词：窖泥，己酸菌，热处理，分离纯化

汪慧慧　杜祥宝　李庆腾　秦方园　李顺涛　习小红　高硕　孙小雨

(山东百脉泉酒业股份有限公司)

1 引言

在中国白酒中，浓香型白酒有举足轻重的地位，其酒质和产量，又离不开生产中菌种质量及数量的多少。己酸菌是浓香型白酒酿造中产己酸乙酯主体香成分的功能菌。它属于厌氧棱状芽孢杆菌，其孢子具有耐热性。近年来，百脉泉酒业技术中心将优质五粮老窖窖泥为基材，对窖泥进行热处理条件的优化，以得到更加优良的己酸菌菌种。该菌种产气旺盛、菌种健壮，广泛应用于浓香型大曲酒的窖池保养、人工窖泥培养等。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

样品：双轮底发酵池的窖泥，五粮发酵池的窖泥，三粮发酵池的窖泥。

培养基：无水乙酸钠5g/L(AR)，酵母膏5g/L(AR)，硫酸铵4g/L(AR)，磷酸氢二钾0.2g/L(AR)，硫酸镁0.2g/L(AR)，碳酸钙5g/L(CP)，硫酸铜指示剂。

器材：立式压力蒸汽灭菌锅，生化培养箱，N-120(A)型生物显微镜，无菌操作台，实验室超纯水器，抽气针筒，移液管。

2.2实验过程

1.用无菌水配置3000ml的己酸菌培养基，封口后，121℃灭菌30分钟。同时灭菌待用的250ml三角瓶，移液管。待培养基降温至32℃～34℃时，放入无菌操作台或无菌接种室紫外线灭菌20分钟，分装至250ml三角瓶备用。

2.取自然发酵池的老窖泥10g，用无菌水定容至100ml，充分混匀。热处理条件进行处理。

3.将热处理后的窖泥加入250ml三角瓶中，接种量为10%，充分混匀。最后每瓶各加乙醇含量为2%～3%，封口后放置33℃的生化培养箱中培养观察。

3结果与讨论

3.1窖泥的选择

取百脉泉酒业的双轮底发酵池的窖泥，五粮发酵池的窖泥，三粮发酵池的窖泥各10g，加无菌水定容至100ml ，摇匀。取原菌液1ml，加9ml的无菌水混匀，依次稀释，得稀释度10-1、10-2、10-3、10-4。用血球计数板显微镜计数，计数时注意稀释度是否合适，不能太浓或太稀，计数得每克窖泥所含的总菌数。

实验测得1g双轮底发酵池的窖泥总菌数为3.8×1010个，1g五粮发酵池的窖泥5.1×1010个，1g三粮发酵池的窖泥2.6×1010个，其中五粮发酵池的窖泥总菌数含量最高，基于窖泥中微生物的种类和数量均定着窖泥的质量，本实验选取五粮发酵池的窖泥为基材，开展己酸菌的热处理条件优化的研究。

3.2窖泥培养液的热处理条件优化

3.2.1热处理温度的选择

取五粮发酵池窖泥，制备菌液，经热处理后接种到液体培养基中，放置33℃的生化培养箱中培养观察。

由表1可以看出，当水浴时间均处理10分钟时，由于不同己酸菌孢子及其他菌类的耐热程度有一定的差异，随着温度的升高，总菌数呈现下降的趋势，但随着温度的上升，生长周期延长，菌种被钝化。

根据生物显微镜观察，不难发现，随着温度的升高，杂菌数量减少，90℃处理培养后未见杂菌。如表1。

3.2.2热处理时间的选择

由于菌液经条件为90℃10min处理后活菌数虽然减少，但根据生物显微镜观察无杂菌，处理后发酵最能达到分离纯化的目的。即本公司选定90℃为热处理温度，水浴时间分别设置为3min，5min，7min，10min，经热处理后接种到液体培养基中，放置33℃的生化培养箱中培养观察。

实验表明，当温度为90℃时，随着处理时间的延长，总菌数减少，且生长周期增长。热处理5min与3min相比而言，总菌数量差别不大，但热处理3min后的培养液，镜检观察有少量杂菌，故本公司选定热处理优化条件为90℃5min。如表2。

3.3己酸菌菌液的性能测试

3.3.1己酸菌产气观察

经热处理后的培养液，生长周期为5天，实验中的生长周期为液体培养基中见明显气泡产生。延长培养时间，以热处理后的液体培养基为母液，接种到第三代时生长周期缩短为4d，产气旺盛，说明热处理使己酸菌纯化，且因受到锻炼而增强了活力。

3.3.2已酸菌镜检及产酸鉴定

延长发酵培养时间到13d，先把待测菌液稀释到合适浓度，用生物显微镜观察只见杆菌和芽孢未见其他杂菌且生长活跃，直接计数可达6.3亿个/m l。

取待测菌液3ml放入比色管内，再加入2%硫酸铜溶液1ml最后加入乙醚2m l，盖好摇匀，静置3分钟，管内分层，上层可见绿色且颜色较深，说明己酸菌生长良好且有己酸产生。

4结论

扩大培养时己酸菌菌种的选取至关重要，本公司对窖泥的热处理优化条件进行了严格检测，热处理温度、时间这两个因素相互影响，在单因素试验结果的基础上，结合本公司对己酸菌培养基扩大培养的纯度要求，优化热处理条件后得到最佳热处理条件为：90℃，5min。

制备的己酸菌菌液菌种健壮活跃、产气旺盛，在扩大培养时要注意厌氧培养，无菌接种操作过程。

制备的培养液广泛应用于浓香型白酒的灌窖、窖池保养以及人工窖泥的培养，以期改善和提高浓香型白酒的质量。